The Oxygraph: Type I oxidatie

[No canvas support]
µl 

Biologische oxidatie van het type I

Biologische oxidaties van het type I, zijn oxidatiereacties waarbij NADH ontstaat. In dit experiment meten we het mitochondriale zuurstofverbruik uitgaande van pyruvaat in af- en aanwezigheid van verschillende hoeveelheden ADP.

Uitvoering

    • Start de simulatie door op "Start" te klikken. Op het scherm ziet u een assenstelsel waarin de zuurstofspanning als functie van de tijd wordt weergegeven. Het signaal verschijnt als een lijn evenwijdig aan de tijd-as.
    • Voeg na ongeveer 20 seconden 10 µl pyruvaat toe. Het aanvankelijk horizontaal lopende signaal verandert van helling, m.a.w. er wordt zuurstof verbruikt.
    • Voeg na ongeveer 30 seconden 4 µl ADP toe. De helling neemt sterk toe maar na enige tijd neemt de hellingshoek weer af tot deze ongeveer gelijk wordt aan de helling die met alleen pyruvaat te meten was.
    • Voeg als deze hoeveelheid ADP verbruikt is 8 µl ADP toe. Opnieuw neemt de hellingshoek eerst toe en daarna weer af. Wat valt u op vergeleken met de vorige ADP-toevoeging?
    • Ongeveer 30 seconden nadat het signaal evenwijdig is geworden aan het signaal zoals gemeten onder punt 2 wordt de simulatie beëindigd door op "Stop" te klikken.
    • Op het scherm kun je de totale weergave van het experiment zien. Met behulp van de cursor, kun je op elk gewenst tijdspunt de tijd, de zuurstofconcentratie en ook de snelheid van zuurstofverbruik op dat specifieke moment aflezen. Bereken nu voor elk van de stukken het bij dat stuk behorende zuurstofverbruik in nanomolen.

U kunt nu bepalen hoeveel ATP (uit ADP) er per zuurstofatoom gevormd is. Dit wordt ook wel de P/O-ratio (veresterd fosfaat / O-atoom) genoemd. Om dit te bepalen moet u eerst de hoeveelheid ATP die gevormd is bepalen (= hoeveelheid veresterd fosfaat). Hiervoor gaan we ervan uit dat alle toegevoegde ADP volledig in ATP wordt omgezet. Vervolgens moet u aan de hand van de gegevens op het scherm het O2-verbruik, en vervolgens het O-verbruik bepalen. Om dit te doen zijn er twee strategieën:

    • U kunt uitgaan van de snelheid van het zuurstofverbruik. Deze kunt u aflezen door met de cursor op de lijn te gaan staan waarvan u de snelheid wilt meten. Vervolgens kunt u linksboven de ΔO2 nmol/min uitlezen. Vervolgens moet u dit vermenigvuldigen met de periode waarover dit heeft plaatsgevonden (de tijd waarin het ADP verbruikt is).
    • U kunt uitgaan van de zuurstofconcentratie in de oxygraaf. Hiervoor moet u het volume van de oxygraaf weten, deze is 2 ml. Door de zuurstofconcentratie op het moment van het injecteren van ADP en de zuurstofconcentratie wanneer al het ADP verbruikt is af te lezen (van de y-as of linksboven de [O2] parameter, let op dit is O2-concentratie), kunt u het zuurstofverbruik bepalen.

⇒ Opgave

- Bereken de P/O ratio van dit experiment. Doe dit volgens een van beide strategieën.

⇒ Vragen

  1. Geef de reactievergelijking voor de oxidatie van pyruvaat tot acetyl-CoA.
  2. Wat is de theoretische P/O-ratio voor een type I oxidatie?
  3. Via welk type oxidatie verloopt de oxidatie van pyruvaat op grond van het gevonden resultaat?
  4. De ademhaling wordt dus inderdaad gecontroleerd door de beschikbaarheid van ADP in theorie zal het zuurstofverbruik in de afwezigheid van ADP miniem zijn. Waarom zult u in een oxygraafregistratie toch altijd een duidelijk zuurstofverbruik in afwezigheid van ADP meten?